Beurteilung des Biofilms

Jun 04, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18669 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Bildung von Biofilmen ist eine der Hauptursachen für Komplikationen nach chirurgischen Eingriffen im klinischen Umfeld. In dieser Studie haben wir die Fähigkeit verschiedener periprothetischer infektionsassoziierter Krankheitserreger zur Biofilmbildung auf medizinisch relevanten Oberflächen, Polystyrol (PS) und Titan (Ti), untersucht. Wir haben auch untersucht, wie ein spezifischer Umweltstressor, Epigallocatechingallat (EGCG), die Biofilmbildung beeinflusst. Erstens ergaben Kongorot-Tests, dass alle Mikroorganismen innerhalb von 72 Stunden Biofilme bildeten. Anschließend wurde das Ausmaß der Biofilmbildung auf PS nach 24, 48 und 72 Stunden sowie auf einer Ti-Platte für 72 Stunden bestimmt. Einige Mikroben bevorzugten eine Oberfläche gegenüber der anderen, während andere Mikroben unabhängig vom Oberflächenmaterial gleichmäßige Mengen an Biofilm bildeten. Staphylococcus lugdunenensis war am wirksamsten, während Enterococcus faecalis und Staphylococcus aureus am schwächsten waren. Tests zur Bakterienadhäsion an Kohlenwasserstoff (BATH) zeigten, dass die Fähigkeit zur Biofilmbildung nicht direkt mit der Hydrophobie der Zelloberfläche (CSH) korrelierte. Schließlich wurde ein externes Signal, EGCG, angewendet, um die Biofilmbildung jedes Mikroorganismus zu verhindern. EGCG regulierte die Fähigkeit jedes Mikroorganismus unterschiedlich, obwohl die Veränderung bei den meisten Krankheitserregern auf allen Oberflächen konsistent war. Diese Studie kann durch den relativen Vergleich ihrer Fähigkeiten zur Biofilmbildung zu einem besseren Verständnis eines breiten Spektrums periprothetischer infektionsassoziierter Krankheitserreger beitragen.

Biofilme sind organisierte Bakteriengemeinschaften, die in einer extrazellulären Matrix eingebettet sind, die aus selbst produzierten extrazellulären Polymersubstanzen wie Polysacchariden, Proteinen, Lipiden und DNA1 besteht. Verschiedene Reize regen Bakterien dazu an, Biofilme auf einer Oberfläche zu bilden2 und sich anders zu verhalten als im planktonischen Wachstumsmodus3. Gefährliche bakterielle Infektionen wie Infektionen der Operationsstelle werden auf diese Bakterien zurückgeführt, die vor herkömmlichen Antibiotika geschützt sind4,5. Bakterien bilden insbesondere Biofilme auf medizinischen Geräten wie Implantaten und verursachen katheterassoziierte Harnwegsinfektionen, periimplantäre Mukositis und Periimplantitis6,7,8. Ein besseres Verständnis der Biofilmbildung kann zu Strategien zur Vorbeugung dieser Infektionskrankheiten führen.

Biofilme können nicht nur durch Bakterien gebildet werden, die von außen eindringen, sondern auch durch Kommensalbakterien, die pathogen werden9. Kommensale Bakterien schützen den Wirt unter normalen physiologischen Bedingungen vor der Besiedlung und dem Eindringen von Krankheitserregern, indem sie antimikrobielle Wirkstoffe produzieren und um Nährstoffe oder Adhäsionsstellen konkurrieren10; Dies ändert sich unter pathologischen oder immunologisch geschwächten Bedingungen, wo sie entzündliche Erkrankungen fördern können, die den Wirt schädigen11. Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa sind die beiden repräsentativen Bakterienarten, die als Hauptursachen für schwere Infektionskrankheiten gelten12. Staphylococcus aureus fungiert typischerweise als Kommensal der menschlichen Mikrobiota, die in der normalen Hautflora, Schleimhaut und im Fortpflanzungstrakt vorkommt13,14,15. Dieses Bakterium kann jedoch verschiedene Krankheiten verursachen, von leichten Infektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Krankheiten. Besonders problematisch sind in Kliniken antibiotikaresistente Stämme wie Methicillin-resistenter S. aureus16. Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer Krankheitserreger bei immungeschwächten Personen17; Obwohl es nicht so virulent ist wie S. aureus, ist P. aeruginosa der häufigste Besiedler von medizinischen Geräten wie Kathetern 18. Koagulase-negative Staphylokokken wie Staphylococcus lugdunensis verursachen ebenfalls viele periprothetische Gelenkinfektionen19. Andere bemerkenswerte pathogene Bakterien, die mit medizinischen Implantaten in Verbindung gebracht werden, sind Streptococcus- und Enterococcus-Arten20.

Verschiedene biologische Mechanismen regulieren die Biofilmbildung. Ein repräsentatives Beispiel ist das Quorum Sensing, also die Fähigkeit, die Genexpression als Reaktion auf die Zellpopulationsdichte zu regulieren21. Die strukturellen Eigenschaften von Mikroorganismen bestimmen auch die Biofilmbildung22. Tatsächlich ist Biofilm das integrierte Ergebnis einer Bakteriengemeinschaft, die interne und externe Faktoren umfasst. Allerdings kann jede darin enthaltene Mikrobe eine einzigartige Fähigkeit haben, einen Biofilm zu bilden, indem sie unterschiedlich auf dasselbe Umweltsignal reagiert. Dennoch haben sich die meisten Studien zu Biofilmen auf eine bestimmte oder einige wenige Arten konzentriert23,24,25. Wir waren davon überzeugt, dass ein kollektiver Ansatz erforderlich ist, um das biofilmbezogene Verhalten einer Bakteriengemeinschaft umfassend zu verstehen. Im Rahmen dieser Studie haben wir ein breites Spektrum medizinisch relevanter Krankheitserreger auf ihre Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen getestet und versucht zu bestätigen, welche Mikroorganismen bei der Biofilmbildung unter Bedingungen, die denen tatsächlicher klinischer Situationen ähneln, robust sind.

In dieser Studie untersuchten wir die Fähigkeit von Krankheitserregern, Biofilme auf Polystyrol (PS)-Kulturröhrchen und Titan (Ti)-Platten zu bilden, deren Oberflächen häufig in medizinischen Bereichen bereitgestellt werden. PS ist ein Kunststoffharz, das für medizinische Geräteanwendungen verwendet wird, darunter transparente Verpackungen, Diagnosekomponenten, Zellkulturschalen und Gehäuse für Testkits26. Ti wird häufig als Material für biomedizinische Implantate und chirurgische Geräte27 verwendet. Jeder Krankheitserreger zeigte die einzigartige Fähigkeit, Biofilme auf PS und Ti zu bilden, und reagierte unterschiedlich auf die Herausforderung mit einem externen Reiz unter Verwendung von Epigallocatechingallat (EGCG). Unter den getesteten Mikroben hatte S. lugdunensis die stärkste Fähigkeit, auf beiden Oberflächen einen Biofilm zu bilden. Das Verständnis der Fähigkeit dieser medizinisch relevanten Krankheitserreger, im klinischen Umfeld Biofilme zu bilden, ist eine Voraussetzung für die Überwindung gefährlicher Infektionen im klinischen Umfeld.

Wir haben zunächst untersucht, ob die Mikroben für diese Studie Biofilme bilden können, da ihre Fähigkeiten bisher unbekannt waren (Ergänzungstabelle 1). Der Kongorot-Test wurde durchgeführt, um Biofilmproduzenten von Nichtproduzenten zu unterscheiden (Abb. 1). In der Brühekultur veränderte sich die mittlere Farbe von S. agalactiae, S. aureus, P. aeruginosa (NCCP 15783), S. lugdunensis, S. epidermidis und E. cloacae nach 24-stündiger Inkubation zu braun oder schwarz, während die von S . anginosus, S. mitis, E. faecalis und K. pneumoniae veränderten sich nach 48 Stunden zu braun oder schwarz. P. mirabilis und die anderen P. aeruginosa (NCCP 16076) verfärbten sich erst nach 72 Stunden mittelbraun oder schwarz. Der nicht biofilmproduzierende P. aeruginosa (NCCP 16076) wurde von nachfolgenden Experimenten ausgeschlossen. In der Agarkultur verfärbten sich die meisten Testkeime, darunter S. agalactiae, S. mitis, S. aureus, P. aeruginosa, S. lugdunensis, E. faecalis und E. cloacae, nach 24-stündiger Inkubation braun oder schwarz, während S . anginosus, S. epidermidis, K. pneumonia oder P. mirabilis zeigten nach 48 oder 72 Stunden braune bis schwarze Kolonien. Obwohl alle hier getesteten Bakterien letztendlich Biofilm produzierten, benötigten sie unterschiedliche Zeiten, um Biofilme zu bilden (Abb. 1b).

Kongorot-Tests zum Screening der Biofilmproduktion von Mikroorganismen. (A). Repräsentative Bilder von Kongorot-Tests mit Bouillonkultur (links) und Agarplatten (rechts) zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 Stunden. (b) Heatmap für Kongorot-Testergebnisse von 11 Mikroorganismen, die in dieser Studie verwendet wurden. Jede Zahl auf der Skalenleiste gibt die Medienfarbe wie folgt an: 1 = Rot, 2 = Dunkelrot, 3 = Braun, 4 = Dunkelbraun, 5 = Schwarz.

Wir untersuchten die Wachstumskurve jedes Mikroorganismus, um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Unterschiede in der Zeit, die zur Bildung von Biofilmen erforderlich ist, auf unterschiedliche Bakterienwachstumsraten zurückzuführen sind (ergänzende Abbildung 1). Die Zeit bis zum Erreichen der stationären Phase betrug je nach Testmikrobe 6–12 Stunden, und das Ausmaß des maximalen Wachstums lag zwischen 0,2 und 0,6 bei einer OD600 (Ergänzungstabelle 2). Obwohl in Abb. 1 gezeigt wurde, dass P. mirabilis am langsamsten einen Biofilm bildet, waren die Zeit bis zur stationären Phase (8 Stunden) und die OD600 zu diesem Zeitpunkt (0,44) nicht niedriger als bei anderen. Mit anderen Worten: Seine Wachstumsrate und Zellzahl waren nicht die niedrigsten unter den Testmikroben. Andererseits erreichte S. aureus, der schnellste Biofilmproduzent in Abb. 1, die stationäre Wachstumsphase nach 10–11 Stunden, was im Vergleich zu anderen Mikroorganismen relativ spät war. Darüber hinaus war S. epidermidis, ein weiterer schneller Biofilmproduzent in Abb. 1, in der Wachstumsrate und dem Ausmaß ähnlich wie P. mirabilis, der langsamste Biofilmproduzent in Abb. 1. Daher zeigt dies den Zeitpunkt und das Ausmaß der Biofilmbildung an Die in Abb. 1 gezeigten Ergebnisse resultieren aus den angeborenen Fähigkeiten jeder Mikrobe zur Biofilmbildung und nicht aus Unterschieden in den Wachstumsraten oder Zellzahlen.

PS wird in medizinischen Bereichen häufig für eine Vielzahl medizinischer Anwendungen verwendet, darunter Diagnosekomponenten, Gehäuse für Testkits und medizinische Geräte, und wird auch als gemeinsame Oberfläche für Biofilmbildungstests verwendet23,26,28. Wir haben jede Mikrobe in einem Kulturröhrchen aus PS kultiviert, um ihre Biofilmbildung auf dieser Oberfläche zu untersuchen. Der Überstand mit nicht anhaftenden Planktonzellen und jedes Kulturröhrchen mit Biofilm wurden nach 24, 48 und 72 Stunden getrennt gesammelt. Die optische Dichte (OD) jedes Überstands wurde bei 600 nm gemessen, um das planktonische Wachstum jedes Mikroorganismus zu untersuchen. Jedes Kulturröhrchen wurde einem CV-Assay (gemessen bei 550 nm) unterzogen, um die Biofilmproduktion zu quantifizieren, deren Werte in Abb. 2a dargestellt sind. Außerdem wurde jede Planktonzelle im Überstand nach der Trennung durch Zentrifugation durch einen CV-Assay quantifiziert (Abb. 2b). Die getesteten Mikroorganismen zeigten in einer 24-Stunden-Kultur unterschiedliche Grade der Biofilmbildung auf PS. Danach erhöhten einige von ihnen, darunter S. agalactiae, die Biofilmbildung auf 48 oder 72 Stunden, während andere, darunter E. faecalis, E. cloacae, K. pneumoniae und P. mirabilis, dazu neigten, ihr ursprüngliches Niveau während des gesamten Experiments beizubehalten. Das Ausmaß der Biofilmbildung auf PS korrelierte nicht mit der Menge oder dem Wachstum planktonischer Zellen (Abb. 2b, c). Interessanterweise war der Planktonzellgehalt von S. lugdunensis trotz seines hohen Biofilmgehalts relativ niedrig, wohingegen E. cloacae, K. pneumoniae und P. mirabilis im Vergleich zur Biofilmproduktion relativ hohe Planktonzellspiegel aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigten, dass der Grad des Planktonzellwachstums und die Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen auf PS nicht direkt miteinander verbunden sind. Tatsächlich ging die Biofilmproduktion bei Mikroben mit hohem Planktonzellwachstum zurück (Abb. 2d). Für ein umfassendes und intuitives Verständnis haben wir jeden Mikroorganismus willkürlich in starke (über 0,2), mittlere (von 0,05 bis 0,2) und schwache (unter 0,05) Gruppen hinsichtlich der Fähigkeit, einen Biofilm auf der PS-Oberfläche zu bilden, entsprechend der CV-Färbung eingeteilt Werte zum 72-Stunden-Zeitpunkt (Tabelle 1).

Biofilmbildung auf Polystyrol (PS)-Oberfläche. Jeder Mikroorganismus wurde 24, 48 oder 72 Stunden lang in PS-Röhrchen kultiviert. Kulturröhrchen und ihre Überstände wurden zu jedem Zeitpunkt separat gesammelt. (a) Die Kulturröhrchen mit Biofilm wurden mit Kristallviolett (CV) gefärbt und ihre Absorption wurde bei 550 nm gemessen, um die Biofilmbildung auf der Oberfläche zu beurteilen. (b) Die Pellets planktonischer Zellen in jedem Überstand wurden separat mit CV gefärbt. Ihre Absorptionen wurden bei 550 nm gemessen, um die Menge an Planktonzellen in der Röhre zu bestimmen. (c) Die optische Dichte (OD) von nicht anhaftenden, planktonischen Zellen enthaltenden Überständen wurde bei 600 nm gemessen. (d) Die aus dem CV-Assay zur Biofilmbildung erhaltenen OD-Werte wurden durch die Summe der OD-Werte aus dem CV-Assay zur Biofilmbildung auf der Oberfläche und aus Planktonzellen enthaltenden Überständen dividiert, um das Verhältnis der Biofilmbildung zu berechnen.

Anschließend untersuchten wir die Fähigkeit der Krankheitserreger zur Biofilmbildung auf Titan (Ti), einem wichtigen und aufkommenden Biomaterial, das häufig in Prothesen verwendet wird27. Nach einer 72-stündigen Bakterienkultur wurden Ti-Platten separat gesammelt, um einen CV-Assay durchzuführen, und die OD jedes verbleibenden Kulturüberstands wurde gemessen, um das Wachstum planktonischer Zellen zu quantifizieren. Aus den Ergebnissen des PS-Experiments geht hervor, dass die OD des Überstands und die CV-Assay-Ergebnisse der Planktonzellen in jedem Überstand proportional waren, sodass im Ti-Experiment der Prozess des CV-Assays von Planktonzellen ausgeschlossen wurde. Wie bei den PS-Ergebnissen bildete jeder Mikroorganismus in unterschiedlichem Maße einen Biofilm auf der Ti-Oberfläche (Abb. 3a). P. aeruginosa und S. lugdunensis erzeugten höhere Biofilmmengen auf Ti, wohingegen S. aureus, S. epidermidis und E. faecalis schwächere Fähigkeiten zeigten. Auch hier korrelierte das Ausmaß des Planktonzellwachstums bei den meisten Testmikroorganismen nicht mit dem Grad der Biofilmbildung (Abb. 3b). Bemerkenswerterweise bildete P. aeruginosa mehr Biofilm, zeigte aber ein geringeres Planktonzellwachstum als andere. Betrachtet man den Grad der Biofilmbildung im Verhältnis zur Gesamtzahl der Bakterien, war die Fähigkeit zur Biofilmbildung bei Mikroben mit hohem Planktonzellwachstum geringer (Abb. 3c). Wie zuvor für PS-Ergebnisse wurde jeder Mikroorganismus durch Klassifizierung in starke (über 0,2), mittlere (von 0,05 bis 0,2) und schwache (unter 0,05) Gruppen hinsichtlich seiner Fähigkeit, Biofilme auf Ti entsprechend den CV-gefärbten Werten zu bilden, relativ verglichen (Tabelle 1).

Biofilmbildung auf Titan (Ti). Jeder Mikroorganismus wurde 72 Stunden lang auf einer Ti-Platte kultiviert. Anschließend wurden die Überstände und Ti-Platten getrennt gesammelt. (a) Die Ti-Platten wurden mit CV gefärbt und ihre Absorption wurde bei 550 nm quantifiziert, um die Bildung von Biofilmen auf der Oberfläche zu erkennen. (b) Die OD von nicht anhaftenden Planktonzellen enthaltenden Überständen wurde bei 600 nm gemessen. (c) Die aus dem CV-Assay zur Biofilmbildung erhaltenen OD-Werte wurden durch die Summe der OD-Werte aus dem CV-Assay zur Biofilmbildung auf der Oberfläche und aus Planktonzellen enthaltenden Überständen dividiert, um das Verhältnis der Biofilmbildung zu berechnen.

Wir verglichen die Biofilmbildungsfähigkeiten der Krankheitserreger auf PS- oder Ti-Oberflächen und fanden je nach Mikroorganismus sowohl konsistente Muster als auch deren Fehlen (Abb. 4). Unter den Testkeimen bildete S. lugdunensis konsistent und stark einen Biofilm sowohl auf PS als auch auf Ti. S. agalactiae, S. anginosus, S. mitis, E. cloacae, K. pneumoniae und P. mirabilis bildeten auf beiden Oberflächen durchgängig mittlere Biofilmniveaus, während E. faecalis auf beiden Oberflächen die schwächsten Fähigkeiten zeigte. Die Fähigkeit der anderen Mikroorganismen zur Biofilmbildung variierte je nach Oberflächentyp. Beispielsweise bildete P. aeruginosa auf Ti ein hohes Maß an Biofilm, auf PS jedoch nicht, und S. aureus zeigte auf PS ein mittleres Maß an Biofilmbildung, auf Ti jedoch ein schwaches Maß. Es wurde deutlich gezeigt, dass jeder Mikroorganismus seine inhärente Fähigkeit zur Biofilmbildung entsprechend einer bestimmten Oberfläche reguliert.

Vergleich der Biofilmbildungsfähigkeiten von PS und Ti. Das Venn-Diagramm vergleicht die Biofilmbildungsfähigkeit jedes Mikroorganismus auf PS oder Ti entsprechend seiner Klassifizierung auf jeder Oberfläche.

Zur Bestimmung der Bakterienanhaftung an Oberflächen wurde die Zelloberflächenhydrophobie (CSH) vorgeschlagen29, daher verglichen wir die CSH jeder Testmikrobe mit ihren Fähigkeiten zur Biofilmbildung auf den Oberflächen (Abb. 5). BATH-Tests zeigten ein breites Spektrum an Hydrophobizität bei den in dieser Studie getesteten Mikroben. CSH korrelierte jedoch nicht mit der gesamten Biofilmbildungsfähigkeit der Mikroorganismen; Die Korrelationsanalyse zwischen CSH- und CV-Werten für Biofilm zeigte, dass der Pearson-r- und P-Wert für die PS-Oberfläche -0,1882 und 0,5194 bzw. für die Ti-Oberfläche -0,1693 und 0,6188 betrug (ergänzende Abbildung 2). Stark hydrophobe Mikroorganismen, darunter S. mitis, und hydrophile, darunter K. pneumoniae, bildeten auf beiden Oberflächen mittlere Biofilmniveaus. S. lugdunensis, der stärkste Biofilmproduzent auf beiden Oberflächen in dieser Studie, wies ebenfalls eine mäßige Hydrophobie auf. Dieses Ergebnis zeigte, dass CSH nicht der primäre Faktor für die Biofilmbildungsfähigkeit der getesteten Krankheitserreger auf den beiden oben gezeigten Oberflächen war.

BATH-Tests zur Hydrophobie der Zelloberfläche. Der Bakterienadhäsions-an-Kohlenwasserstoff-Test (BATH) wurde durchgeführt, um die Hydrophobie der Zelloberfläche jedes Mikroorganismus (%) zu messen. Die Experimente wurden für jeden Mikroorganismus mindestens dreimal wiederholt.

Schließlich untersuchten wir, wie sich ein Umweltdruck auf die Fähigkeit jedes Krankheitserregers auswirken kann, auf beiden Oberflächen einen Biofilm zu bilden. Zu diesem Zweck haben wir EGCG als Überlebenshemmer ausgewählt, da es ein bekanntes antibakterielles Mittel gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen ist30,31. Die Mikroorganismen wurden 72 Stunden lang in Gegenwart von EGCG kultiviert. Abbildung 6 zeigt das Ausmaß der Biofilmbildung jedes Mikroorganismus auf den Oberflächen bei Stimulation mit EGCG. Unter den getesteten Krankheitserregern steigerten oder verringerten acht Mikroorganismen nach der Stimulation die Biofilmproduktion auf PS. Auf Ti beeinflusste EGCG die Biofilmproduktion von neun Mikroorganismen. EGCG veränderte bei den meisten Mikroorganismen konsistent die Muster der Biofilmbildung auf allen Testoberflächen. S. aureus, E. cloacae und K. pneumoniae hielten die Biofilmproduktion auf beiden Oberflächen unabhängig von der EGCG-Stimulation aufrecht, während P. aeruginosa nur auf Ti konsistent Biofilm produzierte. Interessanterweise verhinderte EGCG die Biofilmbildung von S. lugdunensis, dem stärksten Biofilmproduzenten unter den Testmikroorganismen, auf beiden Oberflächen. Insgesamt reagierten die Krankheitserreger unabhängig vom Oberflächentyp auf EGCG. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Durch Epigallocatechingallat (EGCG) induzierte Veränderungen der Biofilmbildung auf PS und Ti. Jeder Mikroorganismus wurde kultiviert, um in Abwesenheit oder Anwesenheit von EGCG Biofilme auf der Oberfläche von PS-Röhrchen oder Ti-Platten zu bilden. (a) Biofilme auf der PS-Röhrenoberfläche wurden mit CV angefärbt und ihre Absorption wurde bei 550 nm gemessen. (b) Biofilme auf der Ti-Plattenoberfläche wurden mit CV angefärbt und ihre Absorption wurde bei 550 nm gemessen.

Mikroben überleben, indem sie Biofilme bilden, die die menschliche Gesundheit und den Lebensstil gefährden32. Biofilm kann sich auf jeder Oberfläche bilden, durch die Wasser fließen kann, beispielsweise in Abflüssen und Booten33. Daher hat die Forschung zur Bildung und Verhinderung von Biofilmen in den Bereichen Wasserwirtschaft und industrielle Wassersysteme besondere Aufmerksamkeit erregt. Hier haben wir die Fähigkeit lebensbedrohlicher Krankheitserreger zur Biofilmbildung auf Oberflächen charakterisiert, die üblicherweise in klinischen Umgebungen verwendet werden und Patienten gefährden können4,34. Ziel dieser Studie ist es, die intrinsischen Fähigkeiten zur Biofilmbildung eines breiten Spektrums klinisch relevanter Krankheitserreger relativ zu vergleichen. Ein interessantes Ergebnis war, dass S. aureus und P. aeruginosa in dieser Studie trotz ihrer Prävalenz in biofilmassoziierten klinischen Situationen nicht die stärksten Biofilmproduzenten waren35. Unterdessen haben wir herausgefunden, dass S. lugdunensis unter den in dieser Studie getesteten Mikroben sowohl auf PS- als auch auf Ti-Oberflächen einen relativ höheren Grad an Biofilm bildete als andere. Daher sind Studien erforderlich, um zu verstehen, warum S. aureus oder P. aeruginosa häufiger als Hauptursache für biofilmbedingte Krankheiten gefunden werden als S. lugdunensis.

Beim Vergleich der Fähigkeiten zur Biofilmbildung mit dem Wachstum planktonischer Zellen in den Abb. 2,3 fanden wir keine direkte Korrelation zwischen ihnen, da die Planktonzellwerte nicht mit den Graden der Biofilmbildung übereinstimmten. Wie in den zuvor veröffentlichten Studien anderer gezeigt wurde, dass das Wachstum von Planktonzellen und die Bildung von Biofilmen unterschiedliche Sätze von Molekülen umfassen36,37, zeigten unsere Ergebnisse auch, dass die Bildung von Biofilmen ein biologischer Prozess ist, der unabhängig und vom Wachstumsmodus der Planktonzellen verschieden ist. Daher ist es schwierig, die Bildung von Biofilmen mit der Eigenschaft des Planktonzellwachstums vorherzusagen.

Ein einzelnes Umweltsignal könnte auch die Fähigkeit einer einzelnen Art zur Biofilmbildung beeinflussen. Epigallocatechingallat (EGCG) ist ein sekundärer Pflanzenstoff, der im Grüntee-Extrakt enthalten ist und eine starke antibakterielle und antibiofilmaktive Wirkung sowohl gegen gramnegative als auch grampositive Bakterien aufweist38,39. Zu den antimikrobiellen Wirkungen von EGCG bei verschiedenen Mikroben gehören die Bindung an und die Schädigung der bakteriellen Zellmembran über die H2O2-Erzeugung40, die Störung bakterieller Membrantransporter41, die Hemmung der bakteriellen Zellbindung an Wirtszellen39, die Reduzierung der bakteriellen H2S-Produktion42 und die Modulation bakterieller Enzyme, einschließlich DNA-Gyrase43. EGCG kommt auch der menschlichen Gesundheit durch entzündungshemmende, krebsbekämpfende und antioxidative Wirkung zu44,45,46. Wir haben jedoch herausgefunden, dass EGCG die Biofilmbildung einiger Mikroben verstärken kann. Der Befund weist darauf hin, dass bei der Verwendung auch nur einer einzigen Chemikalie Vorsicht geboten ist. Wir schlagen daher einen Vorscreening-Test zur Biofilmproduktion von Mikrobiota vor, wenn einem Patienten ein einzelner Wirkstoff verabreicht wird.

Obwohl ein einzelnes Signal die Biofilmbildung jedes Mikroorganismus unterschiedlich regulierte, war das Änderungsmuster bei den meisten Testmikroben für beide Oberflächen konsistent. Dies deutet darauf hin, dass die Biofilmbildung eher durch molekulare Expression als durch Oberflächenmaterialien bestimmt wird. Diese Vorstellung sollte auf anderen Oberflächen weiter getestet werden. Interessanterweise verringerte EGCG die Biofilmproduktion von S. lugdunensis, dem stärksten Biofilmproduzenten unter den Testmikroorganismen, auf beiden Oberflächen. S. lugdunensis ist ein Koagulase-negativer Staphylokokken, der schwere Infektionen verursachen kann, vor allem bei Patienten, die Prothesen verwenden47,48. EGCG regulierte auch die Biofilmbildung von P. aeruginosa deutlich herunter, bei dem sich herausstellte, dass es auf Ti einen relativ höheren Grad an Biofilm bildet. Die Anwendung von EGCG ist daher eine potenzielle Anti-Biofilm-Strategie, beispielsweise für die Oberflächenbeschichtung von prothetischen Implantaten. Andererseits wurde, wie oben erwähnt, die Biofilmbildung einiger Mikroben, einschließlich S. epidermidis, insbesondere auf Ti, durch EGCG hochreguliert. Die durch EGCG-Stimulation erzielten Ergebnisse stellen hilfreiche Hinweise für die Anwendbarkeit der Chemikalie entsprechend den Umständen dar, die den Biofilm der Testmikroben betreffen.

Berichten zufolge ist mikrobielles CSH für die Biofilmbildung von entscheidender Bedeutung29,49,50; Allerdings korrelierte der CSH-Wert der verschiedenen Mikroben, die hier verwendet wurden, nicht mit ihren Fähigkeiten zur Biofilmbildung. Dies stimmt mit einer anderen Studie überein, in der festgestellt wurde, dass CSH nur eine untergeordnete Rolle bei der Bildung von bakteriellem Biofilm spielt51. Doch externe Umweltfaktoren können nicht nur die Biofilmproduktion, sondern auch CSH stören, was zu nachgeschalteten molekularen Veränderungen führen kann, die die Biofilmbildung bestimmen. Das Zusammenspiel dieser Variablen sollte in zukünftigen Studien weiter charakterisiert werden.

Die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft bestimmt wahrscheinlich die Biofilmbildung durch ein kompliziertes Netzwerk biologischer Signale. Dies rechtfertigt den Bedarf an Präzisionsmedizin, da Personen mit unterschiedlichen Mikrobiota unterschiedlich auf ein externes Signal reagieren können. In dieser Hinsicht ist diese Studie von Bedeutung, da sie einen Katalog der Biofilmbildungsfähigkeiten verschiedener Mikroorganismen auf klinisch relevanten Oberflächen bereitstellt. Unsere Arbeit kann vielen zukünftigen Studien helfen, die Klinikern dabei helfen werden, lebensbedrohliche Erkrankungen im klinischen Umfeld zu verhindern. Darüber hinaus kann diese Studie praktische Anwendungen für zukünftige Studien zum bakteriellen Biofilm liefern. Erstens schlägt diese Studie die Verwendung von P. aeruginosa bei der Auswahl eines Probanden für Biofilm-assoziierte Studien nahe an klinischen Modellen vor. Aufgrund der klinischen Inzidenz wurde in vielen Biofilm-assoziierten Studien S. aureus als einziges Testsubjekt verwendet. Diese Studie legt jedoch nahe, dass die einmalige Verwendung von S. aureus zu irreführenden Ergebnissen führen kann. Selbst bei einem einfachen Vergleich in unseren Studien bildete P. aeruginosa eine größere Menge Biofilm auf einer bestimmten Oberfläche, während S. aureus keine signifikante Biofilmbildung zeigte. Vor allem zeigte diese Studie deutlich, dass die Biofilmbildung je nach Material der bereitgestellten Oberfläche unterschiedlich sein kann. Obwohl PS in früheren Studien häufig als Oberflächenmaterial für die Biofilmbildung verwendet wurde, schlagen wir daher vor, dass ein Oberflächenmaterial für Biofilm-assoziierte Studien entsprechend den interessierenden Zwecken ausgewählt werden sollte.

Die in dieser Studie verwendeten Mikroorganismenarten (Ergänzungstabelle 1) wurden aufgrund ihrer Häufigkeit bei periprothetischen Infektionen ausgewählt. Die Mikroben wurden von der National Culture Collection for Pathogens (NCCP, Korea) bezogen. Sofern nicht anders angegeben, wurde Trypsin-Soja-Agar (TSA, Difco) oder Trypsin-Soja-Brühe (TSB, Difco) zur Kultivierung von Bakterien verwendet. Die primäre Bakterienkultur wurde durch Inokulation einer einzelnen Kolonie auf Agarplatten in Brühe und Inkubation über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 120 U/min hergestellt.

Die Kongorot-Brühe und der Agar-Assay wurden wie in anderen Studien beschrieben52,53 vorbereitet. Kurz gesagt, TSB- oder TSA-Medium wurde mit zusätzlichen 3,6 % Saccharose (SIGMA S0389) und 0,08 % Kongorot-Farbstoff (SIGMA C6277) hergestellt. Für den Agartest wurde eine Ösenimpfung des Bakteriums aus einer Übernacht-Brühkultur auf eine Kongorot-haltige TSA-Platte ausgestrichen. Für den Bouillontest wurde eine Bakterienkolonie auf einer TSA-Platte auf kongorothaltiges TSB geimpft. Die Farben der Kolonien oder der Brühe wurden nach 24-, 48- und 72-stündiger Inkubation beobachtet. Braune bis schwarze Farben wurden als positiv für die Biofilmbildung angesehen.

Alle experimentellen Verfahren oder Materialien, Geräte und Ausrüstungen wurden aseptisch durchgeführt oder gewartet; Das Fehlen einer Kreuzkontamination wurde anhand leerer Platten bestätigt. Die Primärkultur wurde mit frischen Nährmedien verdünnt, um für den Biofilmbildungstest auf PS eine optische Dichte (OD) bei 600 nm (OD600) von 0,9 bis 1,0 (DeNovix DS-C Spektrophotometer) zu erreichen. Für diesen Test verwendeten wir 14-ml-Rundbodenröhrchen (40114; SPL Life Sciences, Korea) aus PS, das häufig in Experimenten zur Biofilmbildung verwendet wird22,25. Eine 1-ml-verdünnte Bakteriensuspension wurde in ein 14-ml-Röhrchen mit rundem Boden gegeben, das durch Gammabestrahlung sterilisiert wurde, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C unter Schütteln bei 50 U/min54 für 24, 48 und 72 Stunden. Anschließend wurden die nicht anhaftenden Planktonzellen und die Kulturröhrchen getrennt gesammelt.

Rechteckige TiAl6V4-Platten (Klasse 23: 90 % Titan, 60 % Aluminium, 4 % Vanadium, 20 Breite × 16 Höhe mm; Jeil Medical Corporation, Korea) wurden für den Biofilmbildungstest auf Ti vorbereitet, indem sie in Aceton getaucht und mit hochreinem gespült wurden Wasser, gefolgt von 20-minütigem Autoklavieren bei 121 °C und einem Druck von 15 psi. Nach dem Trocknen in einem Trockenofen bei 60 °C wurde die autoklavierte rechteckige Ti-Platte auf den Boden eines konischen 50-ml-Röhrchens gelegt. Nach 100-facher Verdünnung der Primärkultur (OD600 = ca. 0,01) mit frischer Brühe wurde ein 5-ml-Aliquot der verdünnten Bakteriensuspension in die Ti-haltigen Röhrchen gegeben; Die Ti-Platte war zur Hälfte eingetaucht, um an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche in der Mitte einen Biofilm zu bilden. Die Kappen wurden während der dreitägigen Inkubation bei 37 °C unter Schütteln bei 50 U/min55 fest verschlossen. Schließlich wurden die Ti-Platten getrennt von den nicht anhaftenden Planktonzellen und Kulturröhrchen entnommen.

Die Biofilmbildung wurde durch Anfärben mit Kristallviolettfarbstoff (CV; SIGMA V5265; Sigma-Aldrich, USA) wie zuvor beschrieben quantifiziert56. Nach dreimaligem Waschen mit autoklaviertem Reinstwasser wurden die Planktonzellpellets, -platten oder -röhrchen für 10–15 Minuten in eine 0,1 %ige CV-Lösung gelegt, gefolgt von weiteren drei Wäschen mit autoklaviertem Reinstwasser. Die CV-gefärbten Biofilme und Planktonzellpellets wurden an der Luft getrocknet und dann 15–20 Minuten lang in 30 % Essigsäurelösung (DUCKSAN 414 extra pure grade, Korea) gelöst. Die solubilisierten Fraktionen wurden in dreifacher Ausfertigung (jeweils 100 μl) auf Platten mit 96 Vertiefungen übertragen und ihre Extinktionen (OD550) wurden bei 550 nm57,58 unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrophotometers (TECAN SPARK™ 10 M Multimode Plate Reader mit SPARKCONTROL) bewertet. Die Daten wurden aus wiederholten Experimenten (N = 2 ~ 3) analysiert, darunter n = 9 für PS bzw. n = 4 für Ti.

Die Mikroben wurden 24 Stunden lang bei 37 °C und 120 U/min in 4 ml TSB inkubiert. Die Bakterienkultur über Nacht wurde zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; SIGMA D8537) wie folgt gewaschen: Mikroben wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 4000 U/min pelletiert, und dann wurde der Überstand entfernt, bevor er in PBS resuspendiert wurde. Nach der dreifachen Messung der Absorption bei 600 nm [A] wurde die Bakterienkultur mit 1 ml Decan (SIGMA-ALDRICH D901) versetzt und durch 1-minütiges Vortexen gründlich gemischt, gefolgt von 15-minütigem Stehenlassen bei RT. Die obere decanhaltige Phase wurde entfernt und die Absorption der verbleibenden klaren Phase wurde dreifach bei 600 nm [B] gemessen. Die Ergebnisse wurden mit Gl. analysiert. (1). Mikroben mit einer Hydrophobie unter 20 %, zwischen 20 und 50 % und über 50 % wurden als hydrophil, mäßig hydrophob bzw. stark hydrophob definiert.

Jeder Mikroorganismus wurde nach subjektiven Kriterien auf der Grundlage der aus dem CV-Assay erhaltenen Werte in eine starke, mittlere oder schwache Gruppe eingeteilt, um die Fähigkeit jedes Mikrobens zur Biofilmbildung durch relativen Vergleich intuitiv zu verstehen. Der ungepaarte t-Test und die gewöhnliche einfaktorielle ANOVA wurden mit GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., USA) durchgeführt, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu bewerten. Das Signifikanzniveau zwischen den einzelnen Gruppen betrug P < 0,0001.

EGCG (SIGMA-ALDRICH PHR1333) wurde in sterilisiertem destilliertem Wasser gelöst, um eine 10 mM Stammlösung herzustellen. Anschließend wurde die Stammlösung zweimal durch einen 0,45 μm Spritzenfilter filtriert und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Dem Kulturmedium wurde die richtige Menge Stammlösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen, die in unseren unveröffentlichten Vorversuchen ermittelt wurde.

Eine Kolonie jedes Mikroorganismus auf der Agar-Stammplatte wurde in TSB-Medium (5 ml) inokuliert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Bakterienkultur über Nacht (250 μl) wurde dann im Verhältnis 1:100 (OD600 = etwa 0,01) in neuem TSB-Medium (25 ml) verdünnt und die optische Dichte (OD) wurde bei 600 nm (Zeitpunkt 0) mit einem Spektrophotometer gemessen und anschließend verfolgt durch Inkubation bei 37 °C. Aliquots (1 ml) der Bakterienkultursuspension wurden entnommen und in einstündigen Abständen durch Messung der OD bei 600 nm auf die Wachstumsrate überwacht.

Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Diese Forschung wurde durch den Zuschuss des Korea Medical Device Development Fund unterstützt, der von der koreanischen Regierung finanziert wurde (Ministerium für Wissenschaft und IKT, Ministerium für Handel, Industrie und Energie, Ministerium für Gesundheit und Soziales, Ministerium für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit) ( Projektnummer: KMDF_PR_20200901_0082, 9991006755) und Hallym University Research Fund.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jung-Ah Cho und Yoo Jin Roh.

School of Undergraduate Studies, College of Transdisciplinary Studies, Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology, Daegu, 42988, Republik Korea

Jung-Ah Cho

Abteilung für orthopädische Chirurgie, Dongtan Sacred Hospital, Hallym University, Hwasung, 18450, Republik Korea

Jung-Ah Cho, Hye Rim Son und Sung Jae Kim

Abteilung für Neue Biologie, Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology, Daegu, 42988, Republik Korea

Yoo Jin Roh, Hye Rim Son, Hojung Choi und Chang-Hun Lee

Fakultät für Chemie, Hanyang-Universität, Seoul, 04762, Republik Korea

Hojung Choi

Fakultät für Maschinenbau, Chosun-Universität, Gwangju, 61452, Republik Korea

Jeong-Won Lee

Neues Biologie-Forschungszentrum, Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology, Daegu, 42988, Republik Korea

Chang-Hun Lee

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J.-AC und YJR führten die meisten Experimente durch, analysierten Daten und verfassten die erste Version des Manuskripts. HRS und HJC führten einige wichtige Experimente durch und analysierten Daten. J.-WL, SJK und C.-HL initiierten und betreuten das Projekt, konzipierten die Experimente und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jeong-Won Lee, Sung Jae Kim oder Chang-Hun Lee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Cho, JA., Roh, YJ, Son, HR et al. Bewertung der Biofilmbildungsfähigkeit von periprothetischen infektionsassoziierten Krankheitserregern auf festen Oberflächen. Sci Rep 12, 18669 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22929-z

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Eingegangen: 07. September 2022

Angenommen: 20. Oktober 2022

Veröffentlicht: 04. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22929-z

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